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试剂售后

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藉由良好的售后和管理，基因有限公司竭诚为您服务，有任何关于试剂的疑问，请您在本页的常见问题解答栏目中搜索相关答案。若仍然无法解决您的问题，您可阐明问题，提交下表，基因有限公司的服务人员将第一时间联系您，做初步诊断和后续的售后工作。以便能快速判断问题和解决您的问题。

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基因有限公司试剂市场部

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联系方式： 010-51665161-211(北京)

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常见问题解答

NEB常见问题解答

Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，酶切失败或酶切不完全的原因及解决办法有哪些？
A: 1. 酶失活，酶应贮存在-20℃，-70℃贮存会冻结，另外反复冻融会降低酶活性。通常可用已知多位点对照DNA测试该酶活性。
2. 反应条件未优化，通常应按照推荐方法用限制性内切酶推荐缓冲液进行双酶切或分步酶切（均经过试验验证确认方法是优化的）。
3. 酶浓度过低，某些质粒或基因组DNA需要的酶量在10-20单位/ug。
4. 添加物缺失，解决的办法是重复操作，确保加入的酶或/和添加物（如BSA）
5. DNA浓度不适，NEB推荐50ul反应体系使用1ug DNA，过量DNA会导致酶切不完全。
6. 温育时间过短，某些酶对特定的位点切割速率较慢，绝大多数情况下1-2小时最够了。
7. DNA被抑制剂污染，将底物DNA与对照DNA一起消化，如果存在抑制剂，则对照DNA不会被切割，销量制备的DNA对抑制剂尤为敏感。若被抑制剂污染，可过柱纯化，层析，透析或增加反应体积降低抑制剂浓度。
8. 识别位点不存在，需验证DNA序列是否正确。
9. 酶切位点被甲基化封闭，某些位点会被甲基化阻断，如果位点被阻断，应使用dam+/dam-菌株转化。另外真核基因组DNA可能被CpG甲基化阻断，可将其克隆到细菌宿主以消除影响。
10. DNA可能形成超螺旋，限制性内切酶消化超螺旋DNA效率是不一样的，需加大酶量。
11. 识别位点过于接近DNA末端，一般在识别为点两端各加上6个保护碱基，确保切割效率。
12. 位点优势效应，需要两个识别位点确保以达到有效切割。
Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若出现非预期带型该如何解决？
A: 1. 首先要确定正确的带型，通常将对照底物DNA与酶切产物凝胶电泳，部分消化会有相应未消化底物条带，星号活性会产生非预期条带。
2. DNA样品污染，应重新制备DNA样品。
3. DNA含有其他识别位点，验证DNA序列。
Q: NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若DNA电泳呈现弥散状该如何解决？
A: 1. 酶与DNA结合紧密未完全解离，在凝胶上样缓冲液或反应终止液中加入SDS至终浓度为0.1-0.5%以帮助解离。
2.核酸酶污染，操作时应注意避免交叉污染。
3.琼脂糖电泳条件不当，应使用新鲜缓冲液及合适电压，避免过热。
Q: 什么是同裂酶？
A: 识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶。第一个被发现的内切酶称之为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称之为同裂酶。
Q: NEB采用蓝冰运输的好处有哪些？
A: 1. 实验证明，使用蓝冰方法运输，既使到货时蓝冰已经溶化，泡沫塑料盒中的温度仍然能保持在4℃或4℃以下超过24小时。虽然NEB公司建议酶类产品贮存于-20°C，但在运输过程中，温度暂时维持在4°C至10°C之间不会对酶活性产生不良影响。事实上，在纯化这些产品的过程中，为了去除蛋白酶和其他可能影响酶稳定性的污染源时，所使用的温度就是4°C，并且纯化过程通常需要持续3周之久。此外，每种酶都贮存于NEB特定的贮存液中，该贮存液经过优化，对保持酶活的稳定性也会起到重要作用。
2.NEB产品贮存液中含有50％甘油，可以使酶在-35°C下保持液态。但是如果使用干冰运输，酶将被冷冻，如此反复冻

Corning常见问题分析

Q: 组织培养（TC）处理表面和CellBIND处理表面细胞培养系列产品主要区别在哪？

A: 组织培养（TC）处理的表面适用于普通的贴壁细胞培养，而CellBIND表面细胞培养系列产品，更易细胞黏附培养，适用于难贴壁细胞的培养，同时也能减少培养时血清用量至5%，大大降低细胞培养成本。

Q: Corning与Corstar培养瓶细胞产量与推荐培养基体积是多少？

Corning与Corstar培养瓶	生长面积（cm²）	平均细胞产量（个）	推荐培养基体积 (mL)	最大工作体积(mL)
625px2	25	2.5×10⁶	5-7.5	10
1875px2斜颈	75	7.5×10⁶	15-22.5	60
3750px2	150	1.5×10⁷	30-45	210
4375px2	175	1.75×10⁷	35-52.5	250
225m2	225	2.25×10⁷	45-67.5	370

Q: Corning培养皿细胞产量与推荐培养基体积?

Corning培养皿	生长面积（cm²）	平均细胞产量（个）	推荐培养基体积(mL)
35mm	8	8×10⁵	1.6-2.4
60mm	21	2.1×10⁶	4.2-6.3
100mm	55	5.5×10⁶	11-16.5
150mm	148	1.48×10⁷	30-45

Q:Corning细胞培养板根据颜色可分几种？区别是什么？

A: 根据颜色可分为三种：第一种为透明细胞培养板，通用的细胞培养板；第二种为黑色细胞培养板，常用于细胞培养后荧光分析，可降低背景与信号的交叉干扰。另外还有黑色底透细胞培养板，底透的设计可直接从底部读数；第三种为白色细胞培养板，主要用于细胞培养后发光检测分析，可增加信号。另外还有白色底透细胞培养板，也可直接从底部读数。

Q: Corning Transwell的应用领域有哪些？

A: 细胞黏附分析、细胞共培养、毒理与药物检测、发育生物学研究、感染性疾病研究、肿瘤细胞浸润分析、细胞趋化与趋药分析、细胞分泌研究、运输性与渗透性研究、细胞极性研究、血脑屏障研究模型等。

Q: Corning Transwell板有三种膜，PC、PET与PTFE；那么怎么知道那种最合适分析实验呢？

A: Transwell通透性支持物有三种材料：聚酯（PET），聚碳酸酯（PC）与聚四氟乙烯（PTFE），它们各有不同的特点。PET Transwell是透明的，适合在相差显微镜下观察；PTFE包被胶原，做成Transwell-COL，湿润后透明，适合需要胶原存在的细胞分析；其余的分析适合用PC膜的Transwell

Q: 在选择Transwell时除了考虑膜的材质外，还有哪些因素比较重要？

A: 在实验中使用Transwell 透过性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的。最小孔径的Transwell 膜（0.1 µm）主要应用于药物转运研究。细胞侵袭、趋化性和运动性研究通常采用5.0µm与8.0µm 或以上孔径的Transwell 膜。细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系及培养条件有关，同时也与孔径相关。小于3.0µm 孔径条件下，细胞不会迁徙通过。对于一些要求严格的实验，建议在实验中选用一系列孔径作为对照来确定那种尺寸最适合于你的细胞培养和特殊应用。还有一个方法就是参照已经发表的文献的推荐。

Q: 使用冻存管时，有什么需要注意的？

A: 1. 使用时，塑料冻存管必须存放在液氮罐中气相处（Vapor phase），请勿将装有细胞的冻存管直接浸泡于液氮的液相（Liquid phase）处。不正确的使用方法可能会使液态氮浸入冻存管中，取出时造成液态氮瞬间汽化和压力上升，会造成爆管或生物污染物的泄漏等。

2. 从液氮罐中取出冻存管时为确保您的安全，请务必佩戴标准配备，包括防护面具，抗冻手套，实验服以保护您的眼，手及身体。

CST常见问题回答

Q: 我该如何储存我的抗体？多高的温度会影响抗体的稳定性？
A: 请将抗体的原始管储存到-20°C，不要分装，否则有可能引起抗体的改变和浪费。提供的抗体贮存在包含50%甘油缓冲液中，在推荐的储存温度下不会冷冻。这避免了由于反复冻融导致的抗体降解。偶联抗体可以储存在4°C，请参照产品说明书上的建议储存。
Q: 如何储存SDS 裂解的磷酸化蛋白样本？
A: 如果短期内使用( 少于3 个月)，SDS 样本细胞裂解液可以储存在-20℃，如果长期储存，应保存于-80℃。活化的蛋白样本的降解变化很大，其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化的蛋白。
Q: 能用室温孵育抗体1 小时代替4℃过夜吗？
A: 不建议。CST 公司活化特异的抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基。这些修饰包括磷酸化，乙酰化和酶切割。与识别总蛋白的抗体相比，大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的亲和性。因此，通过4℃孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的信噪比是非常关键的。
Q: 当我准备细胞裂解液样品时，需使用什么缓冲液？
A: 请检查每个产品说明书中包含的Western blot 操作步骤中推荐的缓冲液。或者，如果你想自己配制，CST 网站上列出了特别的缓冲液组分。CHAPS 缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计，适应于Caspase 的检测，但并非关键。
Q: CST的抗体是否适用于全组织样本裂解物？
A: CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物，但是CST 的很多抗体已经被其他客户用于整个组织而且取得巨大成功。
Q: 如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照？
A: 请参考CST 网站上该产品的Western blot 图，使用图述的细胞系和药物处理，能够得到阳性对照蛋白。也可参见：www.cellsignal.com/support/controls.html 查阅
Q: 假如说明书上某个种属未被列出与CST抗体有交叉反应，是否意味着这个种属未被检测过呢？
A: 可能未被检测过。CST科学家检测所有CST抗体在多个物种的交叉反应性，如果可能的话（这个依赖于目标蛋白和实验系统的可行性）。假如我们没有获得某个种属的交叉反应的阳性结果，我们就不会列出这个种属。然而，有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水平的特定蛋白，或者，我们使用的诱导条件对那个特定的细胞系不起作用。
Q: 使用CST抗体时，为什么我不能使用我们自己实验室的免疫印迹操作流程？
A: CST抗体经过优化以提供最强的信号，最少的背景，使用CST推荐的免疫印迹操作流程，对于终端客户的优点是节约时间和材料。
Q: 如何确保Western blot 结果的可重复性？
A: 至于为什么看起来较难重复Western blot 结果，这里有几种可能性。要发现这种情况的原因，可考虑以下：
1）你是如何储存抗体的？请参考问题1，2。
抗体稀释后不能重复使用。许多抗体有一个非常低的工作浓度，很可能这个浓度随着连续的Western blot 会减少。
2）你确定你的样本中包含活化的蛋白？细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量，药物诱导时间，细胞传代数量和储存条件不同而改变。
Q: 如何使用固相抗体来做免疫沉淀？
A: 要得到最佳的结果，获得均匀的微珠悬浮液是重要的。以下步骤可确保同质：
• 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶10 分钟。
• 倒置管子几次以获得50% 微珠- 缓冲液悬浮液。
• 假如可能，温和漩涡管子。
• 为了迅速吸出产品，切掉吸管端头，将吸管端头插入微珠悬浮液使靠近固相抗体微珠混合物。孵育抗体和200μg的细胞裂解物( 约1mg/ml)4℃过夜，用推荐的抗体稀释浓度。
Q: 为什么我们的抗体能够在常温下运输？
A: 与CST在环境方面的巨大努力一致，我们从2003年开始，在常温下运输抗体，尽可能的减少包装材料的浪费。每个CST™抗体都需经过稳定性检测，先在常温和37°C下放置一周，然后进行免疫印迹测试以确保抗体的性能没有改变。如果你收到的抗体保存在常温中，请放心它已经通过稳定性测试，抗体的性能仍然是最优的。抗体接收后，请按照产品说明书中的推荐温度储存。

抗体常见问题解答（适合CST、Santa、Abcam等）

Q: 如何选择合适的一抗？

A: 请先确定您要检测的种属和使用的实验方法，然后查找相关产品，根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测，则您可以放心地购买该产品。

Q: 如何选择合适的二抗？

A: 二抗的选择原则：

* 针对一抗来源的二抗（比如一抗是小鼠来源的，二抗就要是抗小鼠的）

* 针对一抗Ig亚型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗体）

* 为了增加特异性、降低背景：可以选择Fab段的抗体（去除Fc段的）、经过标本来源种属血清吸附的的二抗

* 查看二抗的说明书，选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗

Q: 如何选择同型对照？

A: 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如：一抗是FITC标记，其抗体分型是小鼠的IgG1，则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1。

Q: 如何选择阳性对照？

A: 阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据，也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据！尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时，最好的选择是实验合适的阳性对照

大部分抗体的说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时，请参考以下条款：

* 看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照！

* 根据说明书上的Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织，这也可以作为合适的阳性对照！

* 查查该蛋白的GeneCards 吧，这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。

* 如果上述方法还是不能找到合适的阳性对照，推荐您去PubMed 查查发表文章，看看有无文章报道该蛋白表达的细胞和组织。

Q: 如何确定一抗的稀释比例？

A: 如果说明书中有推荐的稀释比例，请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响，推荐浓度仅作为参考。实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。

如果说明书没有推荐稀释比例，仅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的预实验来摸索最佳的比例了。下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度，可以作为预实验的参考。未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度，因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度，实验者可以参考下表中“估计浓度”确定各种实验稀释比例。

请记住，下表中的各种稀释比例和工作浓度仅仅是作为一个起始点，需要根据试验结果来进行适当的调整。最好以此起点作一系列的浓度，从中确定最佳的工作浓度和稀释比例！

	组织培养上清	腹水	全抗血清	纯化抗体
WB / dot blot	1/100	1/1000	1/500	1 ug/ml
IHC / ICC	neat - 1/10	1/100	1/50 - 1/100	5 ug/ml
EIA / ELISA	1/1000	1/10000	1/5000	0.1 ug/ml
FC	1/100	1/1000	1/500	1 ug/ml
IP		1/100	1/50-1/100	1 - 10 ug/ml
Concentration estimate	1 - 3 mg/ml	5 - 10 mg/ml	1 - 10 mg/ml

Q: 如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法？

A: 有些抗体对抗原修复方式有特别要求的，一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。但是很多抗体并没有一个特别的推荐，就需要实验者自己来进行优化和摸索了。

Q: 为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别？

A: WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的，通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的，这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素：

* 翻译后修饰－比如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量

* 翻译后剪切－比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式，如pro-caspases

* 不同剪切体－有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的

* 相对电荷（Relative charge）－氨基酸的组成(charged vs non-charged)

* 多聚体－如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件，因此造成检测的条带偏大

ChIP疑难排解指南

Q:消化的染色质浓度过低（低染色质产率）

A: 可能是添加到染色质消化的组织或细胞不足或者细胞核在消化后未完全裂解。建议在每次IP添加额外染色质，达到至少5 μg/IP的水平，然后继续操作流程。或者在交联前对组织称重或对单独的细胞板技术以测定准确的细胞数目。某些组织每次IP可能需要处理25mg以上。组织含量可增加至每次IP 50mg，而仍保持高效的染色质片段化和提取。增加染色质消化之后超声处理的次数。在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核的完全裂解。

Q:染色质消化不足且片段过大（多于900个碱基对）。染色质片段较大导致本底增加和分辨率降低？

A:可能是在染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。建议在交联前对组织称重或对单独的细胞板计数以确定准确的细胞数目。在染色质消化中添加更少组织或细胞，或更多微球菌核酸酶。
LONZA细胞培养基常见问题

Q: L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
A: L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
Q: 哪种培养基中可以省去加酚红？
A: 酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
Q: 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
A: 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
Q: 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
A: 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
Q: 在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
A: 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
Q: 在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？
A: 随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
Q: 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?
A: 这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)
Q: 为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
A: 胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。保存血清最好的方法? 我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
Q: 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
A: 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
Q: 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
A: 有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
Q: 怎样避免沉淀物的产生?
A: 我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。 (2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 (3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 (5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。