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测序
Even more from Less - NEBNext Ultra II RNA 文库制备试剂盒
您是否需要提高 RNA-seq 实验的灵敏度与特异性？您是否遇到更低起始量样本？为了解决这些挑战，新一代的 RNA 文库制备试剂盒中每一个步骤
都经过优化，在更低起始量，更少循环数的条件下，依旧能够得到数倍产量的高质量文库。文库制备试剂盒流程化，自动化的操作流程，适用于
定向（链特异性文库，使用“dUTP”方法（1,2））及非定向文库制备，更有包含 SPRISelect® 磁珠的形式，方便片段筛选及纯化步骤。
分别使用 NEBNext Ultra II RNA 定向文库制备试剂盒 (搭配NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块)，Kapa Stranded mRNA-SeqKit， Kapa mRNA HyperPrep Kit，Illumina TruSeq Stranded mRNA
Kit将带有 Poly(A) 尾的 mRNA 从 Human Universal Reference RNA(Agilent #740000) 中分离出来建库。制备好的文库在 Illumina NextSeq® 500 平台用双端模式 (2x76 bp) 测序。Reads 比对到hg19 参考基因组。每个文库的 GC 含量分布使用比对上的reads 进行计算。NEBNext Ultra II 定向 RNA 文库制备试剂盒制备的文库在不同起始量条件下有均一的 GC 含量分布，而其他试剂盒 GC 含量分布会随着不同起始量产生变化，显示了起始量依赖序偏嗜性。
*以上内容来源于NEB（北京）
NEBNext Ultra Ⅱ DNA 文库构建产品
NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒能够用更低起始量的 DNA 构建高质量的文库。文库制备每一个步骤中的试剂都经过优化，能够从 500 pg 至 1 μg 的起始 DNA 高效构建高质量的文库。新一代的 NEBNext 试剂采用了快速、流程化、自动化的工作流程，在降低 PCR 循环数的同时提高了 GC 覆盖度。本试剂盒与 PCR-free 的工作流程兼容，且对于难以建库的样本，如 FFPE 样本，也有很好的效果。
优势：
更高的文库产量，满足您更多需求；
即使在 DNA 样本量非常低的情况下（低至 500 pg），依旧能够产生高质量的文库；
适用于所有 DNA 样本，包括富含 GC 的区域及 FFPE-DNA 样本；
提高靶向富集等应用的产量及质量；
流程化的操作过程，操作时间大大减少，与自动化建库设备兼容；试剂盒和模块提供了极大的选择灵活性。
NEBNext Ultra II DNA建库工作流程
NEBNext Ultra II DNA文库试剂盒组成
A： 以人 NA19240 基因组 DNA 为样本制备文库，起始量和 PCR 循环数如图所示。文库构建按照各生产商推荐方法进行，省略片段筛选的步骤。
B： 以人 NA19240 基因组 DNA 为样本制备文库，起始量和制备试剂盒如图所示，文库的构建按照生产商推荐的方法进行，不进行扩增步骤。接头连接的分子用 qPCR 进行定量，定量的结果以 Ultra II 的转化率为基准进行标准化处理。对于不同起始量 DNA， Ultra II 试剂盒均能产生最高的接头连接分子转化效率。
以 500 pg，1 ng 及 100 ng 的基因组 DNA 为起始样本，使用 Ultra II DNA 文库制备试剂盒进行建库后使用 Illumina MiSeq® 测序。使用 Bowtie 2.2.4 将 Reads 进行比对并使用 Picard's Collect GC Bias
Metrics (v1.117) 计算 GC 覆盖度。预期的标准化覆盖度 1.0 以灰色的水平线表示，不同 GC% 中 100 bp 区域的数量以灰色条形图显示。不同颜色的线形图表示标准化后的文库覆盖度。
以 100 ng 人 NA19240 基因组 DNA 为起始样本构建文库，文库制备试剂盒如图所示，文库的构建按照生产商推荐的方法进行，不进行扩增步骤。文库产量用 NEBNext 文库定量试剂盒进行 qPCR 定量。使用NEBNext Ultra II 试剂盒得到的文库产量最高。
以 100 ng 人 NA19240 基因组 DNA 为起始样本构建文库，使用的文库制备试剂盒如图所示，文库的构建按照生产商推荐的方法进行，不进行扩增步骤。文库使用 Illumina NextSeq 500 进行测序。测序得到的
Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比对到 GRCh37 参考基因组。数据显示 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒
在 PCR-free 实验流程中得到高质量的测序读数，即使在起始量非常低的情况下。
% Mapped: 比对到 人 GRCh37 参考基因组的百分比。
% Duplication: 比对序列中重复的百分比。
% Chimeras: 序列中超过最大插入片段或两端比对到不同染色体上的百分比。
以 17-30 ng 的 FFPE 组织样本中提取的 DNA 为起始样本制备文库，组织来源如上表所示，扩增循环数为 10 个循环，用Illumina MiSeq 进行测序。
测序得到的 Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比对到 GRCh37 参考基因组
% Mapped: 比对到 人 GRCh37 参考基因组的百分比。
% Mapped in Pairs: mate pair 也能比对到参考基因组的百分比。
% Duplication: 比对序列中重复的百分比。
% Chimeras: 序列中超过最大插入片段或两端比对到不同染色体上的百分比。
数据显示使用 NEBNext DNA 文库制备试剂盒能够获得高质量的测序结果，即使是起始量非常低的 FFPE 样本。
当使用 Nimblegen 进行靶向富集时，首先以 100 ng 人 HG02922 基因组 DNA 为起始样本，分别使用NEBNext Ultra II 及 NEBNext 接头引物，或 Kapa 文库制备试剂盒 SeqCap® 接头(Roche)。随后的靶向富集使用 NimbleGen SeqCap Human Exome v3 试剂盒完成。
当使用 Sureselect 进行靶向富集，首先以 200 ng 人 HG02922 基因组 DNA 为起始样本，分别使用
NEBNext Ultra II 及 NEBNext 接头引物，Kapa 文库制备试剂盒及 NEBNext 接头引物，和 SureSelect Reagent Kit，Illumina (ILM) 平台配合 Herculase® II Fusion DNA 聚合酶进行建库。随后的靶向富集使用 SureSelect® Human All Exon V6 试剂盒完成。
实验均按照生产商推荐的方法进行，包括推荐的 PCR 循环数及捕获前和捕获后处理。使用 NEBNext Ultra II 构建的文库在两种富集方法下均可获得更高的捕获后产量。
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